Amniotic membrane as a biological scaffold for dental pulp stem cell transplantation in ocular surface reconstruction / Membrana amniótica como substrato biológico para o transplante de células-tronco da polpa do dente de leite na reconstrução da superfície ocular

ABSTRACT Purpose: To evaluate the ability of human immature dental pulp stem cells, which are mesenchymal stem cells of neural crest origin, to differentiate into the corneal epithelium for purposes of corneal transplantation and tissue engineering when cultured on de-epithelized amniotic membranes. Methods: We compared the immunophenotypes (ABCG2, K3/12, and vimentin) of cells grown on amniotic membranes or plastic surfaces under serum-free conditions or in culture media containing serum or serum replacement components. Results: Immature dental pulp stem cells grown on amniotic membranes under basal conditions are able to maintain their undifferentiated state. Our data also suggest that the culture medium used in the present work can modulate the expression of immature dental pulp stem cell markers, thus inducing epithelial differentiation of these cells in vitro. Conclusions: Our results suggest that the amniotic membrane is a good choice for the growth and transplantation of mesenchymal stem cells, particularly immature dental pulp stem cells, in clinical ocular surface reconstruction.

RESUMO Objetivos: Avaliar a capacidade das células-tronco imaturas da polpa do dente de leite que são células-tronco mesenquimais de origem da crista neural, de se diferenciarem no epitélio corneano para fins de transplante de córnea e engenharia de tecidos quando cultivadas em membrana amnióticas desepitelizadas. Métodos: Foram comparamos so imunofenótipo (ABCG2, CK3/12 e vimentina) de células cultivadas em membranas amnióticas ou em superfícies plásticas sob condições livres de soro ou em meios de cultura contendo soro ou componentes de substituição de soro. Resultados: Células-tronco imaturas da polpa do dente de leite cultivadas sobre membrana amniótica em condições basais são capazes de manter seu estado indiferenciado. Nossos dados também sugerem que o meio de cultura utilizado no presente trabalho pode modular a expressão de marcadores de células-tronco imaturas da polpa do dente de leite, induzindo a diferenciação epitelial destas células in vitro. Conclusão: Nossos resultados sugerem que a membrana amniótica é uma boa escolha para o crescimento e transplante de células-tronco mesenquimais, particularmente as células-tronco imaturas da polpa do dente de leite, na reconstrução da superfície ocular.

Clinical features and corneal optical anisotropies in a rabbit model of limbal stem cell deficiency / Fenótipos clínicos e anisotropias ópticas da córnea em coelhos com deficiência de células tronco limbais

ABSTRACT Purposes: To investigate the intra-laboratory reproducibility of clinical features and to evaluate corneal optical anisotropies in a rabbit model of limbal stem cell deficiency. Methods: Limbal injury was induced in the right eye of 23 adult New Zealand White rabbits using a highly aggressive protocol that combined 360 degrees limbal peritomy, keratolimbectomy, alkaline chemical burn, and mechanical removal of the epithelium. Clinical evaluation of the injured eyes was performed for 28 days and included corneal impression cytology. Corneas with a severe clinical outcome set typical of limbal stem cell deficiency were then collected, subjected to a histopathological examination, and examined for optical anisotropies. Corneas from healthy rabbit eyes were used as controls. Differences in optical path due to stromal collagen birefringence, as well as linear dichroism related to the expression and spatial orientation of glycosaminoglycan chains from proteoglycans, were measured from cross-sections under a quantitative polarized light microscope. Results: One eye showed signs of hypopyon and was excluded. Signs of ocular inflammation were observed in all eyes studied (n=22). Corneal impression cytology did not detect goblet cells. Twelve of the 22 corneas presented a clinical outcome set typical of limbal stem cell deficiency, which is characterized by the presence of epithelial defects, inflammatory cells, moderate-to-severe opacity, and neovascularization. Microscopic studies under polarized light revealed that relative to controls, limbal stem cell deficiency caused a 24.4% increase in corneal optical path differences. Further, corneas with limbal stem cell deficiency were less dichroic than controls. Conclusions: These results suggest that rabbit models of limbal stem cell deficiency must be rigorously screened for use in preclinical studies to ensure experimental homogeneity because protocols used to create limbal stem cell deficiency could be not associated with good intra-laboratory reproducibility of clinical features. Limbal stem cell deficiency, as induced herein, altered the optical anisotropic properties of the corneal stroma. Such alterations are indicative of changes in collagen packing and the spatial orientation of glycosaminoglycan chains from proteoglycans. Knowledge of these changes is important to potentiate strategies aimed at restoring the morphofunctional integrity of the corneal stroma affected by limbal stem cell deficiency.

RESUMO Objetivos: Investigar a reprodutibilidade intra-la­boratorial dos fenótipos clínicos e avaliar anisotropias ópticas em córneas de coelhos com deficiência de células tronco limbais. Métodos: Lesões ao limbo foram feitas no olho direito de 23 coelhos adultos da Nova Zelândia Branco, usando um protocolo altamente agressivo, que envolveu peritomia limbal em 360 graus, ceratolimbectomia, cauterização por álcali, e remoção mecânica de epitélio remanescente. Os olhos foram clinicamente avaliados por 28 dias, inclusive por citologia de impressão corneal. As córneas que manifestaram um conjunto de alterações típicas de deficiência de células tronco limbais foram coletadas e submetidas à estudos em histopatologia e em anisotropias ópticas. Córneas saudáveis foram usadas como controles. Diferenças de caminho óptico de birrefringência relacionada à organização do colágeno estromal, e dicroísmo linear relacionado à expressão e à orientação das cadeias de glicosaminoglicanos dos proteoglicanos estromais, foram quantificados por microscopia de luz polarizada. Resultados: Um olho apresentou hipópio e foi excluído do estudo. Todos os olhos estudados (n=22) apresentaram sinais de inflamação ocular. A citologia de impressão não detectou células caliciformes na superfície corneal. Doze de 22 córneas manifestaram alterações clínicas típicas de deficiência de células tronco limbais, caracterizado por defeitos epiteliais, infiltrados inflamatórios, opacidade de moderada à severa, e neovascularização. Estudos por microscopia de luz polarizada mostraram que a deficiência de células tronco limbais aumentou a diferenças de caminho óptico corneal em 24,4% (versus controles). As cór­neas com deficiência de células tronco limbais foram menos dicroicas do que as córneas controle. Conclusões: Coelhos com deficiência de células tronco limbais, para aplicações em estudos pré-clínicos, devem ser rigorosamente selecionados para assegurar homogeneidade experimental, pois há evidências de que protocolos utilizados para indução de deficiência de células tronco limbais não estão associados com boa reprodutibilidade intra-laboratorial de fenótipos clínicos. A deficiência de células tronco limbais, como induzida aqui, alterou as propriedades ópticas anisotrópicas do estroma corneal. Tais alterações são indicativas de mudanças no empacotamento de colágeno e na orientação das cadeias de glicosaminoglicanos dos proteoglicanos. Conhecimentos nessas alterações são importantes para potencializar estratégias que visam a restabelecer a integridade morfofuncional do estromal corneal acometido pela deficiência de células tronco limbais.

A supramolecular look at microenvironmental regulation of limbal epithelial stem cells and the differentiation of their progeny / Uma visão supramolecular sobre a regulação microambiental de células tronco epiteliais limbais e a diferenciação de sua progênie

ABSTRACT Various approaches have been taken to improve our knowledge of the microenvironmental regulation of limbal epithelial stem cells. Researchers have extensively investigated the roles of growth factors, survival factors, cytokines, enzymes, and permeable molecules secreted by the limbal cells. However, recent evidence suggests that stem cell fate (i.e., self-renewal or differentiation) can also be influenced by biophysical and mechanical cues related to the supramolecular organization and the liquid crystalline (mesophase) nature of the stromal extracellular matrix. These cues can be sensed by stem cells and transduced into intracellular biochemical and functional responses, a process known as mechanotransduction. The objective of this review is to offer perspectives on the supramolecular microenvironmental regulation of limbal epithelial stem cells and the differentiation of their progeny.

RESUMO Muitas abordagens têm sido utilizadas para ampliar entendimentos sobre a regulação microambiental das células tronco epiteliais limbais. Neste contexto, pesquisadores têm exaustivamente investigado a participação de fatores de crescimento, fatores de sobrevida, citocinas, enzimas e moléculas permeáveis secretadas pelas células limbais. Entretanto, evidências recentes sugerem que o destino (ie. autorrenovação ou recrutamento para a via de diferenciação) das células tronco também sofre influência de estímulos biofísicos ou mecânicos relacionados à organização supramolecular e à natureza liquido-cristalina (mesofases) da matriz extracelular estromal. Esses estímulos podem ser percebidos e traduzidos pelas células tronco em sinais bioquímicos que geram respostas funcionais, através de um processo designado de mecanotransdução. Objetiva-se, com a presente revisão, oferecer ao leitor perspectivas supramoleculares sobre a regulação microambiental das células tronco epiteliais limbais e a diferenciação de sua progênie.

Assessment of surgical outcomes of limbal transplantation using simple limbal epithelial transplantation technique in patients with total unilateral limbal deficiency / Avaliação dos resultados cirúrgicos do transplante de limbo utilizando a técnica SLET (simple limbal epithelial transplantation), em pacientes com deficiência límbica total unilateral

ABSTRACT This study aimed to evaluate the effectiveness of the novel simple limbal epithelial transplantation (SLET) technique, which reduces the risk of iatrogenic limbal stem cell deficiency in the donor eye. Four patients with total unilateral limbal stem cell deficiency received a limbal graft, measuring 4 mm × 2 mm, from the contralateral healthy eye in a single surgical procedure. The graft was divided into 10-20 pieces and distributed on the corneal surface. At 6-month follow-up, a completely avascular corneal epithelial surface was obtained in two patients, and there was improvement in visual acuity in one patient. The limbal grafts did not adhere to the cornea in one patient. No serious complications related to the surgery were observed in this study.

RESUMO Este trabalho tem como objetivo avaliar a eficácia de uma nova técnica cirúrgica denominada SLET (simple limbal epithelial transplantation), um procedimento promissor que reduz os riscos de indução de deficiência límbica iatrogênica no olho doador. Quatro pacientes com deficiência límbica total unilateral, secundária a queimadura química, receberam um enxerto de células límbicas, medindo 4 mm x 2 mm, do olho contralateral sadio, em apenas um tempo cirúrgico. Este foi divido em 10 a 20 fragmentos e distribuído sobre a superfície da córnea. Após 6 meses de cirurgia, superfície corneana totalmente epitelizada e avascular foi obtida em dois pacientes. Houve melhora da acuidade visual em um paciente. Não houve aderência dos enxertos de limbo na córnea em um paciente. Nenhum paciente apresentou efeitos colaterais graves decorrentes do procedimento cirúrgico.

Limbal transplantation at a tertiary hospital in Brazil: a retrospective study / Transplante de limbo em hospital terciário no Brasil: estudo retrospectivo

ABSTRACTPurpose:Epidemiological analysis of limbal transplantation surgeries performed in the Ophthalmologic Hospital of Sorocaba.Methods:Retrospective medical records review of 30 patients who underwent limbal stem cell transplants between January 2003 and March 2008. Cases involving conjunctival limbal autograft were classified as group I, and those involving conjunctival limbal allograft as group II.Results:Two patients were excluded due to incomplete data during postoperative follow-up. Of the total sample of 28 patients, 53.6% constituted group I, whereas 46.4% were included in group II. Males were predominant (67.9%), and right eyes were the most prevalent (67.9%). The mean age was 40.3 years. Unilateral cases accounted for 60.7%. The most frequent pathology causing limbal system failure was chemical burns (53%). The mean length of time from diagnosis to surgery was 11.18 years. The limbal graft and amniotic membrane were associated in 75% of all cases, and tarsorrhaphy in 57.1%. The average follow-up period was 24.84 months. The uncorrected visual acuity improved in 38% of the cases, was unchanged in 28.5%, and deteriorated in 33.3%. There was no persistent epithelial defect in 75% of the patients. The conjunctivalization rate was similar between the groups (53.3% and 58.3%, respectively). The transparency improved in only 38.4% of the cases, and 28.5% of the surgeries performed were successful. The most prevalent complication was persistent epithelial defect, which occurred in 25% of the patients, followed by corneal melting in 14.2%. Other complications observed included infectious ulcers, limbal graft necrosis or ischemia, perforation, and descemetocele.Conclusion:Chemical burns remain the main cause of limbal stem cell deficiency. In these cases, limbal transplantation is the standard procedure to restore the ocular surface even though the success rate is low.

RESUMOObjetivo:Análise epidemiológica dos transplantes de limbo realizados no Hospital Oftalmológico de Sorocaba.Método:Foi realizada uma análise retrospectiva através de revisão de prontuário de trinta casos de transplante de limbo realizados no período de janeiro de 2003 a março de 2008. Casos de transplante de limbo autólogo foram classificados como grupo I e alogênicos como grupo II.Resultados:Dois pacientes foram excluídos da análise por insuficiência de dados nos registros. Da amostra completa de 28 pacientes, 53,6% constituíram o grupo I enquanto 46,4% o grupo II. O olho direito (68%) e o sexo masculino (68%) foram mais acometidos, com uma média de idade de 40,3 anos. Casos unilaterais contabilizaram 60,7%. A patologia de base causadora da deficiência límbica mais prevalente foi a queimadura química (53%). A média do tempo de doença até a cirurgia foi de 11,18 anos. Na maioria dos casos o transplante foi associado a membrana amniótica (75%) e tarsorrafia (57%). O tempo médio de seguimento foi de 24,84 meses. Foi observado melhora da acuidade visual não corrigida em 38% dos casos enquanto 28,5% permaneceram inalteradas e 33,3% pioraram. Evolução sem defeito epitelial persistente ocorreu em 75% dos pacientes. A taxa de conjuntivalização foi semelhante nos 2 grupos (53,3% e 58,3%). Em apenas 38% dos casos houve melhora da transparência. A taxa de sucesso foi de cerca de 28%. A complicação mais prevalente foi defeito epitelial persistente (25%) seguida de melting (14,2%). Outras complicações observadas foram úlceras infecciosas, necrose ou isquemia do enxerto, perfuração e descemetocele.Conclusões:A queimadura química permanece como principal patologia causadora de deficiência límbica. Nestes casos o transplante de limbo é atualmente a técnica de eleição para restauração da superfície ocular, porém com baixa taxa de sucesso.

Impression cytology in the evaluation of ocular surface tumors: review article / Citologia de impressão na avaliação de tumores da superfície ocular: artigo de revisão

Impression cytology (IC) has been widely used as a method for evaluating the ocular surface and superficial cells layers in the diagnosis and follow-up after treatment of several ocular surface tumors of both epithelial and melanocytic origin. Information regarding this can be found in the English-language literature since 1992. Using either cellulose acetate or Biopore membranes for specimen collection, a high correlation has been found between IC and tissue histology. Compared with exfoliative cytology with spatula, IC is less traumatic to the patient’s eye, provides a precise location of the area being studied, and allows accurate observation of the cells the way they exist in vivo. The additional advantage of IC is the preservation of limbal stem cells responsible for continuous corneal epithelium renewal; these can be affected after incisional or excisional biopsy at the corneoscleral limbus, which is the most frequent site of appearance of tumors in the stratified epithelium. Treatment for ocular surface squamous neoplasia has historically included surgery, but nonsurgical interventions have also been adopted. Hence, in certain cases, ophthalmologists may prefer interventions less invasive than surgical biopsy such as of impression cytology for both initial diagnosis and therapeutic monitoring of treatment for ocular surface lesions. Nevertheless, it should be considered that IC may be less helpful if the results conflict with the clinical picture or if the clinical diagnosis is uncertain and results are negative. In such cases, surgical biopsy is required for accurate diagnosis. The purpose of this review is to examine the published literature on the utilization of IC for the diagnosis and management of ocular surface tumors and to discuss the requirement for further investigation on the subject.

A citologia de impressão (CI) tem sido amplamente utilizada como um método de avaliação da superfície ocular e das camadas de células superficiais no diagnóstico e no seguimento após tratamento de vários tumores da superfície ocular de origem epitelial ou melanocítica. As informações podem sem encontradas na literatura em língua inglesa desde 1992. Utilizando-se de membranas de acetato de celulose ou Biopore na coleta dos espécimes, uma alta correlação tem sido encontrada entre a CI e a histologia do tecido. Comparando-se com a citologia esfoliativa, a citologia de impressão é menos traumática para o olho do paciente, fornece uma localização precisa da área estudada e permite ver as células da forma como elas organizam-se in vivo. A vantagem adicional da citologia de impressão é a preservação das células- tronco germinativas responsáveis pela renovação contínua do epitélio da córnea. Elas podem ser afetadas após biópsia cirúrgica na região do limbo que é o sítio mais frequentemente acometido pelos tumores do epitélio estratificado. O tratamento para a neoplasia escamosa da superfície ocular tem sido historicamente a cirurgia, mas intervenções não cirúrgicas também foram adotadas. Por esta razão, em certos casos, oftalmologistas podem recorrer a formas menos invasivas que a biópsia cirúrgica (como a citologia de impressão) tanto para o diagnóstico inicial quanto para o monitoramento terapêutico das lesões da superfície ocular. No entanto, deve-se ter em mente que a citologia de impressão deixa de ser útil quando seu resultado não coincide com o quadro clínico ou quando o diagnóstico clínico é incerto e o resultado da citologia de impressão negativo. Nesses casos, a biópsia cirúrgica deve ser realizada para o diagnóstico. O objetivo desta revisão é examinar a literatura sobre a utilização da citologia de impressão no diagnóstico e tratamento dos tumores da superfície ocular bem como discutir a necessidade de uma investigação mais aprofundada sobre o assunto.

Use of impression cytology for the detection of unsuspected ocular surface squamous neoplasia cells in pterygia / Uso da citologia de impressão para a detecção de células de neoplasia escamosa da superfície ocular insuspeita em pterígios

Purpose: To evaluate the agreement between the methodologies of impression cytology (IC) and histopathology regarding epithelial lesions clinically diagnosed as pterygium and also regarding the detection of unsuspected and associated ocular surface squamous neoplasia (OSSN). Methods: Thirty-two Brazilian patients were included and IC was performed on all pterygia before excision. Histopathogical examination was considered the gold standard and was performed by two experienced ocular pathologists in which consensus existed regarding pterygia diagnosis. IC accuracy was assessed by sensitivity and specificity with a 95% confidence interval. Results: From the 32 primary lesions studied, histopathological examination confirmed the diagnosis of pterygium without atypical cells in 19 cases (60%) and showed unsuspected and associated OSSN cells in 13 cases (40%). IC demonstrated one false-negative and one false-positive result for atypia. Statistical analysis showed an estimated sensitivity of 92%, specificity of 94%, positive predictive value of 92%, and negative predictive value of 94%. Conclusion: IC demonstrated high agreement with histopathological analysis in the detection of atypical epithelial cells in unsuspected OSSN in Brazilian pterygia patients. .

Objetivo: Avaliar a concordância entre a citologia de impressão (CI) e os achados histopatológicos de lesões epiteliais clinicamente diagnosticadas como pterígio, no que tange a detecção de células de neoplasia escamosa da superfície ocular (NESO) insuspeita associada. Métodos: Trinta e dois pacientes brasileiros foram incluídos e a CI foi obtida de todos os pterígios antes da excisão. O exame histopatológico foi realizado por dois patologistas oculares experientes em consenso de opinião e considerado o padrão-ouro para o diagnóstico. A acurácia da CI foi avaliada pela sensibilidade e especificidade com intervalo de confiança de 95% Resultados: Das 32 lesões estudadas, o exame histopatológico confirmou o diagnóstico de pterígio sem atipia em 19 casos (60%) e mostrou células de NESO insuspeita associada em 13 espécimes (40%). A CI demonstrou um resultado falso-positivo e um falso-negativo para atipia. A análise estatística mostrou uma sensibilidade estimada de 92%, especificidade de 94%, valor preditivo positivo de 92% e valor preditivo negativo de 94%. Conclusão: A CI apresentou alta concordância com o estudo histopatológico na detecção de células epiteliais atípicas de NESO insuspeita em pterígios do Brasil. .

Treatment of astigmatism during phacoemulsification / Tratamento do astigmatismo durante a facoemulsificação

Purpose: To compare the effectiveness of limbal relaxing incisions (LRI) with that of toric intraocular lens (IOL) implantation for the treatment of astigmatism during phacoemulsification using nonvectorial (predictability, safety, and efficacy) and vectorial analyses. Methods: This longitudinal observational case series assessed 62 eyes of 31 consecutive cataract patients with preoperative corneal astigmatism of 0.75-2.50 diopters (D) in both eyes. Patients were randomly assigned to 2 groups: a toric IOL group, which received toric IOLs in both eyes, and an LRI group, which received spherical IOLs associated with LRI placement in both eyes. All patients were evaluated at 1, 3, and 6 months after surgery, when refractive astigmatism analysis was performed using both nonvectorial and Alpins vectorial methods. Outcomes were assessed within each group and compared between groups. Results: The proportion of eyes within ±0.50 D of the intended correction at 3 and 6 months after surgery was 75% and 71.88%, respectively, in the LRI group and 40% and 66.67%, respectively, in the toric IOL group. In the remaining period, the proportion was greater in the toric IOL group. The safety index showed no difference at any time point. The efficacy index at 1 and 3 months after surgery was significantly higher in the toric IOL group (0.43 and 0.44, respectively) than in the LRI group (0.31 and 0.36, respectively). At 6 months after surgery, the status of eyes in the LRI group was as follows: 53.13% were undercorrected, 43.74% achieved the intended correction, and 3.13% were overcorrected. In the toric IOL group, 16.76% eyes were undercorrected, 76.67% achieved the intended correction, and 6.67% were overcorrected. The success rates for astigmatic surgery, astigmatism reduction at the intended axis, and astigmatism corrected were 43%, 62%, and 64%, respectively, in the LRI group and 57%, 81%, and 94%, respectively, in the toric IOL group. Conclusions: ...

Objetivo: Comparar incisões relaxantes limbares (IRL) e lentes intraoculares (LIO) tóricas tanto em termos não-vetoriais (efetividade, segurança e eficácia), quanto vetoriais no tratamento do astigmatismo por ocasião da facoemulsificação. Métodos: Estudo observacional longitudinal (série de casos) no qual foram avaliados 62 olhos de 31 pacientes consecutivos de catarata com astigmatismo corneano pré-operatório entre 0,75 e 2,50 dioptrias (D) para ambos os olhos. Os pacientes foram aleatoriamente distribuídos entre 2 grupos: "1" submetido a implante de lentes intraoculares AcrySof ToricTM em ambos os olhos e "2" com implante bilateral de lentes intraoculares tóricas AcrySof NaturalTM complementada por incisões relaxantes limbares. Todos os pacientes foram reavaliados com 1, 3 e 6 meses de pós-operatório, sendo feitas análises do astigmatismo refracional por métodos não-vetoriais, como pela análise vetorial de Alpins, interessando os resultados dentro de cada grupo e entre os grupos. Resultados: O porcentual de olhos entre ±0,50 D da correção pretendida no grupo incisões relaxantes limbares foi de 75 e 71,88%, respectivamente, em comparação aos 40 e 66,67% do grupo lentes intraoculares tóricas aos 3 e 6 meses de pós-operatório. Nos outros períodos avaliados, os porcentuais foram favoráveis ao grupo lentes intraoculares tóricas. O índice de segurança não demonstrou diferença em nenhum dos períodos. O índice de eficácia foi estatisticamente maior para o grupo lentes intraoculares tórica com 1 e 3 meses de pós-operatório (0,43 e 0,44), em comparação ao grupo incisões relaxantes limbares (0,31 e 0,36). Aos 6 meses, o porcentual de olhos, para o grupo incisões relaxantes limbares, foi: hipocorreção ...

Efficacy of three different methods for side port incision wound sealing

PURPOSE: To evaluate wound leakage and bacteria-sized particle influx in differently corneal sealed side port incisions. METHODS: Four 1.5mm tunnel squared incisions were created in each of four cadaveric human eyes. In each cornea, one incision was left unsealed, whereas the other three incisions were sealed using a 10-0 nylon suture, cyanoacrylate glue, or stromal hydration, respectively. A Seidel and an India ink test were performed on each eye. During each Seidel test, flourescein was applied, the IOP increased from 15 to 80mmHg, and the IOP at which each incision started to leak recorded. During each India ink test, ink was placed on the eye and rinsed out with balanced salt solution (BSS). Ink penetration was then measured by planimetry at physiologic conditions and after an IOP plunge from 80mmHg to 0mmHg. RESULTS: Regardless of IOP variations, no leakage or ink inflow was observed through the glued incisions. In contrast, leakage did occur in the other three sealing methods, albeit at significantly different IOP levels in each one (p=0.013). Ink inflow occurred in these sealing methods at physiologic IOP and, to a significantly greater extent, after the IOP challenge (p<0.05). At both of these IOP conditions, the differences in ink influx among these three incision-sealing methods were deemed statistically insignificant. CONCLUSION: This study showed that glue was more effective at preventing wound leakage and bacteria-sized particle influx than other commonly used methods especially hydrosealing.

OBJETIVO: Avaliar o sinal de Seidel positivo e a penetração de tinta da Índia em incisões corneanas acessórias seladas por diferentes métodos. MÉTODOS: Quatro incisões de 1,5 x 1,5mm foram criadas em cada um dos quatro olhos provindos do banco de olhos. Em cada córnea, uma incisão foi mantida sem manipulação, enquanto que as outras três incisões foram seladas respectivamente com Nylon 10-0, cola de cianoacrilato e hidratação estromal. Foram realizados dois testes: Sinal de Seidel positivo e penetração da tinta da Índia. No primeiro, foi aplicado fluoresceína gotas e a pressão intraocular (PIO) elevada de 15 para 80mmHg. No segundo, a tinta da Índia foi aplicada sobre o olho estudado em duas situações: sob PIO fisiológica e sob variação súbita da pressão, de 80 para 0mmHg. RESULTADOS: Na incisão selada com cola, apesar da variação da PIO, não houve vazamento e nem penetração de partículas de tinta. Por outro lado, o sinal de Seidel foi positivo nas outras três incisões em diferentes níveis de PIO (p=0,013). A penetração da tinta da Índia ocorreu nestas três incisões sob pressão fisiológica e com maior extensão após a variação da PIO (p<0,05). Esta diferença, no entanto não foi considerada estatisticamente significante quando comparadas as incisões entre si. CONCLUSÃO: No presente estudo, a cola foi mais eficaz em prevenir Seidel e entrada de partículas do que outro método comumente usado especialmente, hidratação estromal.

Impression cytology and in vivo confocal microscopy in corneas with total limbal stem cell deficiency / Citologia de impressão e microscopia confocal in vivo em córneas com deficiência total das células-tronco do limbo

PURPOSES: To describe corneal changes seen on in vivo confocal microscopy in patients with total limbal stem cell deficiency and to correlate them with cytological findings. METHODS: A prospective case series including 13 eyes (8 patients) with total limbal deficiency was carried out. Stem cell deficiency was diagnosed clinically and by corneal impression cytology. Confocal images of the central cornea were taken with the Heidelberg Retina Tomograph II, Rostock Corneal Module (Heidelberg Engineering, Heidelberg, Germany). RESULTS: Impression cytology of the cornea revealed conjunctival epithelial cells and goblet cells in all cases. In vivo confocal microscopy showed disruption of normal layers of the corneal epithelium in all eyes. Confocal images showed cells with characteristics of conjunctival epithelium at the cornea in 76.9% of the total. These findings on confocal microscopy were compatible to limbal stem cell deficiency. Additionally, goblet cells, squamous metaplasia, inflammatory cells and dendritic cells were observed. The sub-basal nerve plexus was not identified in any of the corneas. Corneal neovessels were observed at the epithelium and stroma. All cases showed diffuse hyper-reflective images of the stroma corresponding to opacity of the tissue. CONCLUSIONS: Limbal stem cell deficiency had been confirmed by impression cytology in all cases, and 76.9% of the cases could also be diagnosed by in vivo confocal microscopy through the conjunctival epithelial cell visualization on the corneal surface. Frequent confocal microscopy findings were abnormal cells at the cornea (conjunctival epithelial, goblet and inflammatory cells), corneal neovessels and diffuse hyper-reflection of the stroma.

OBJETIVOS: Descrever as alterações corneais observadas na microscopia confocal in vivo e relacioná-las aos achados da citologia de impressão em pacientes com deficiência total das células-tronco do limbo. MÉTODOS: Série de casos prospectiva incluindo 13 olhos (8 pacientes) com deficiência total das células-tronco do limbo. A deficiência límbica foi diagnosticada clinicamente e mediante citologia de impressão da córnea. Imagens confocais da córnea central foram obtidas com o Heidelberg Retina Tomograph II, Rostock Corneal Module (Heidelberg Engineering, Heidelberg, Alemanha). RESULTADOS: A citologia de impressão da córnea demonstrou células epiteliais da conjuntiva e células caliciformes em todos os casos. A microscopia confocal da área central da córnea mostrou alteração da estrutura normal das camadas do epitélio corneal em todos os casos. As imagens confocais da córnea mostraram a presença de células com características do epitélio conjuntival em 76,9%. Esses achados no exame confocal são compatíveis com deficiência das células-tronco do limbo. Adicionalmente, células caliciformes, metaplasia escamosa, células inflamatórias e dendríticas foram observadas. O plexo nervoso sub-basal não foi identificado em nenhum dos casos. Neovasos corneais foram observados no epitélio e no estroma. Em todos os casos havia imagens difusamente hiperreflectivas no estroma, correspondendo à opacidade do tecido. CONCLUSÕES: A deficiência das células-tronco do limbo, previamente confirmada por citologia de impressão, pôde ser demonstrada pela microscopia confocal in vivo em 76,9% dos casos através da visualização de células epiteliais da conjuntiva na córnea. Achados frequentes na microscopia confocal foram células anormais na córnea (células conjuntivais, caliciformes e inflamatórias), neovasos corneais e hiperreflexão difusa do estroma.

Alpins and thibos vectorial astigmatism analyses: proposal of a linear regression model between methods / Análises vetoriais de alpins e thibos para o astigmatismo - proposta de modelo de regressão linear entre os métodos

PURPOSE: To determine linear regression models between Alpins descriptive indices and Thibos astigmatic power vectors (APV), assessing the validity and strength of such correlations. METHODS: This case series prospectively assessed 62 eyes of 31 consecutive cataract patients with preoperative corneal astigmatism between 0.75 and 2.50 diopters in both eyes. Patients were randomly assorted among two phacoemulsification groups: one assigned to receive AcrySof®Toric intraocular lens (IOL) in both eyes and another assigned to have AcrySof Natural IOL associated with limbal relaxing incisions, also in both eyes. All patients were reevaluated postoperatively at 6 months, when refractive astigmatism analysis was performed using both Alpins and Thibos methods. The ratio between Thibos postoperative APV and preoperative APV (APVratio) and its linear regression to Alpins percentage of success of astigmatic surgery, percentage of astigmatism corrected and percentage of astigmatism reduction at the intended axis were assessed. RESULTS: Significant negative correlation between the ratio of post- and preoperative Thibos APVratio and Alpins percentage of success (%Success) was found (Spearman's ρ=-0.93); linear regression is given by the following equation: %Success = (-APVratio + 1.00)x100. CONCLUSION: The linear regression we found between APVratio and %Success permits a validated mathematical inference concerning the overall success of astigmatic surgery.

OBJETIVO: Estabelecer modelos de regressão linear entre os índices propostos por Alpins com os vetores astigmáticos de Thibos, avaliando a validade e a força dessas correlações. MÉTODOS: Série de casos na qual foram avaliados prospectivamente 62 olhos de 31 pacientes de catarata com astigmatismo corneano pré-operatório entre 0,75 e 2,50 dioptrias para ambos os olhos. Os pacientes foram aleatoriamente distribuídos entre 2 grupos: um submetido a implante de lente intraocular (LIO) AcrySof ToricTM em ambos os olhos e outro grupo, no qual seriam implantadas LIO AcrySof NaturalTM complementada por incisões relaxantes limbares, também em ambos os olhos. Todos os pacientes foram reavaliados aos 6 meses de pós-operatório, sendo feitas análises do astigmatismo refracional tanto pelo método vetorial proposto por Alpins, quanto pelo proposto por Thibos. A razão entre os vetores astigmáticos pós e pré-operatórios de Thibos (VApós/pré), bem como a correlação linear com o percentual de sucesso da cirurgia do astigmatismo, o percentual de astigmatismo corrigido e o percentual de redução do astigmatismo no eixo pretendido, propostos por Alpins, foram avaliados. RESULTADOS: Foi encontrada correlação negativa significativa entre a VApós/pré de Thibos e o percentual de sucesso da cirurgia do astigmatismo (%Successo), de Alpins (ρ de Spearman=-0.93); regressão linear dada pela seguinte equação: %Successo = (-VApós/pré + 1,00)x100. CONCLUSÃO: A regressão linear encontrada entre VApós/pré e %Successo permite uma inferência matemática validada a respeito do sucesso de cirurgia do astigmatismo em termos gerais.

Cytological features of live limbal tissue donor eyes for autograft or allograft limbal stem cell transplantation / Características citológicas do tecido límbico de doador vivo para transplante autólogo ou alógeno de células-tronco epiteliais corneais

PURPOSE: To evaluate by impression cytology (IC) the corneal surface of live limbal tissue donor eyes for autograft or allograft limbal stem cell transplantation (LSCT). METHODS: Twenty limbal donors were enrolled (17 for autograft LSCT and 3 for allograft). Impression cytology was performed before transplantation of superior and inferior limbal grafts and after the third postoperative month. RESULTS: Impression cytology analysis showed sheets of corneal epithelial cells and goblet cell absence beyond the edge of the keratectomy sites in all patients, suggesting that conjunctival invasion towards the center did not occur in any eye. Partial conjunctivalization within 2 to 3 clock hours, confirmed by the presence of goblet cells, was limited to the keratectomy site in 10 percent of the cases. CONCLUSION: A clear central corneal surface was demonstrated in all eyes following surgery leading to the conclusion that limbal donation was a safe procedure in this group of patients. A small percentage of eyes can have donor sites re-epithelized with conjunctival cells at the periphery of the cornea.

OBJETIVO: Avaliar pela citologia de impressão a superfície da córnea de doador vivo para transplante autólogo ou alógeno de células-tronco epiteliais. MÉTODOS: Vinte pacientes doadores de tecido límbico foram avaliados (17 para transplante autólogo e 3 para alógeno). Os exames citológicos foram realizados em dois momentos: antes da ceratectomia, que removeu tecido límbico dos quadrantes superior e inferior, e após o terceiro mês pós-operatório. RESULTADOS: Invasão de células da conjuntiva em direção ao centro além da margem da ceratectomia não ocorreu em nenhum olho estudado. Uma pequena área de conjuntivalização parcial, confirmada pela presença de células caliciformes, foi detectada dentro do limite da ceratectomia em 10 por cento dos casos. CONCLUSÃO: A superfície central da córnea manteve-se transparente demonstrando que a manipulação de tecido límbico em doador vivo foi um procedimento seguro neste grupo de pacientes. Uma pequena porcentagem dos olhos pode ter o local do sítio da ceratectomia re-epitelizado com células da conjuntiva sobre a periferia da córnea.

Comparação entre membrana amniótica com e sem epitélio como substrato para cultura de células epiteliais do limbo ex vivo / Comparison between amniotic membrane with and without epithelium as a support for human limbal epithelial cells cultured ex vivo

OBJETIVO: Avaliar a eficácia e aspecto estrutural de células límbicas epiteliais humanas cultivadas sobre membrana amniótica (MA) com e sem epitélio. MÉTODOS: As culturas límbicas foram obtidas a partir de rima corneoescleral remanescentes de transplantes de córnea de 6 diferentes doadores. Cada explante foi cultivado em três diferentes grupos: MA desepitelizada por tripsina (Grupo 1), MA com epitélio íntegro (Grupo 2) e controle (Grupo 3). A migração epitelial foi avaliada por microscopia de contraste de fase. Após 15 dias, as células cultivadas sobre MA foram submetidas à microscopia eletrônica para avaliar migração e adesão epitelial. RESULTADOS: Todas as células do grupo controle cresceram até atingir confluência. Somente uma das culturas em membrana amniótica desepitelizada não apresentou crescimento epitelial. O crescimento de células epiteliais sobre membrana amniótica epitelizada foi observada em apenas uma cultura. CONCLUSÃO: Baseando-se nestes achados, o uso de membrana amniótica desepitelizada aparenta ser o melhor substrato para migração e adesão epitelial comparando com membrana amniótica epitelizada. Remover o epitélio da membrana amniótica demonstra ser um importante passo para estabelecer culturas de células sobre membrana amniótica.

PURPOSE: To evaluate the efficacy and ultrastructural aspects of human limbal epithelial cells cultured on amniotic membrane (AM) with and without epithelium. METHODS: Limbal epithelial cell cultures were established from cadaveric cor neo-scleral rim explants derived from 6 different donors. The explants from each donor were placed under 3 different groups: on human preserved AM with epithelium (Group 1), AM deepithelialized with trypsin (Group 2) and control (Group 3). The epithelial cell migration was evaluated under phase contrast microscopy. After 15 days, the amniotic membrane with cells cultures were removed and submitted to scanning and transmission electron microscopy to check for epithelial migration and adhesion. RESULTS: All epithelial cell cultures from the controls grew over the botton of the culture plate wells until reaching confluence. Epithelial cultures grew over all but one denuded amniotic membrane. In the group amniotic membrane with epithelium, epithelial cell growing was observed only in 1 well. CONCLUSIONS: Using this model, denuded amniotic membrane appeared to be the best substrate for epithelial cell migration and adhesion comparing to amniotic membrane with epithelium. Removal of amniotic membrane epithelial seems to be an important step for establishing limbal epithelial cell culture on amniotic membrane.

Uso de células-tronco cultivadas ex vivo na reconstrução da superfície ocular / Use of stem cells cultured ex vivo for ocular surface reconstruction

Lesões na superfície ocular podem atingir as células-tronco do limbo e causar deficiência límbica. A deficiência límbica é caracterizada pela conjuntivalização, que pode ser definida como a invasão do epitélio conjuntival sobre a córnea. Este processo é acompanhado por graus variáveis de alterações corneanas, como neovascularização, inflamação, erosões recorrentes, defeitos epiteliais persistentes, destruição da membrana basal do epitélio e cicatrização estromal. Frequentemente, estas alterações estão associadas à diminuição da acuidade visual, fotofobia e desconforto ocular. O melhor tratamento para essa afecção não é conhecido e possibilidades variam em casos uni ou bilaterais. Entre os tratamentos disponíveis, o transplante de limbo autólogo ou alógeno é um dos mais utilizados. Para melhorar os resultados dos transplantes alógenos, alguns pesquisadores utilizam o transplante de epitélio da córnea cultivado em laboratório pela expansão ex vivo de células-tronco epiteliais límbicas. Mas devido à limitada disponibilidade de tecido autólogo do limbo e o risco de complicações associadas à imunossupressão em transplante de tecido alógeno, pesquisas de outras opções de células-tronco cultivadas ex vivo têm sido descritas em fase experimental e clínica. Essa revisão descreve os novos tipos de células-tronco cultivadas ex vivo, seus resultados atuais e potencialidades futuras.

Lesions on the ocular surface can destroy the stem cells from the limbus and cause limbal stem cell deficiency. The limbal stem cell deficiency is marked by conjunctivalization, which can be defined as the invasion of conjunctival epithelium over the cornea. This process is accompanied by varying degrees of corneal changes such as neovascularization, inflammation, recurrent erosions, persistent epithelial defects, destruction of basement membrane of epithelium and stromal healing. Often, these changes are associated with poor visual acuity, photophobia and ocular discomfort. The best treatment for this disease is not known and varies in unilateral or bilateral cases. Among the treatments available, transplantation of limbal autograft or allograft is one of the most used. To improve the outcome of allotransplantation, some researchers use the transplantation of corneal epithelium cultured in the laboratory by ex vivo expansion of limbal stem cells, but due to limited availability of autologous tissue from the limbus and the risk of complications associated with immunosuppression in allogeneic tissue transplantation, researches of others options of stem cell cultured ex vivo have been described in experimental and clinical stage. This review describes the new types of stem cells cultured ex vivo, their current results and future potential.

Transplante de células-tronco epiteliais límbicas alógenas expandidas ex vivo sobre membrana amniótica: relato de caso / Transplantation of allogenic limbal epithelial stem cells cultivated ex vivo on amniotic membrane: case report

Paciente apresentou falência de transplante de limbo e conjuntiva de doador vivo alógeno no olho direito após ceratoconjuntivite epidêmica. Após alguns meses, foi submetida a transplante de células-tronco epiteliais límbicas alógenas cultivadas ex vivo sobre membrana amniótica (primeiro caso no Brasil), tendo evoluído com epitelização total da córnea e melhora da acuidade visual. Após o 3º mês da cirurgia, iniciou-se neovascularização superficial periférica com piora da transparência corneana. A visão manteve-se 0,1 após um ano de cirurgia.

Case report of a patient who developed failure of an allogenic living related conjunctival limbal transplantation in the right eye after an episode of epidemic keratoconjunctivitis. After a few months, she underwent transplantation of allogenic limbal epithelial stem cells cultivated ex vivo on amniotic membrane (first case in Brazil). The patient evolved with total corneal epithelialization and improvement of the visual acuity. Three months after the surgery, peripheral superficial neovascularization with worsening of the corneal transparency was observed. The vision remained 0.1 after one year of the transplantation.

HLA-matched living-related conjunctival limbal allograft for bilateral ocular surface disorders: long-term results / Transplante alogênico inter vivo de limbo conjuntival com pareamento HLA em doenças bilaterais da superfície ocular: resultados em longo prazo

PURPOSE: To evaluate the long-term outcome of HLA-matched lr-CLAL for bilateral ocular surface disorders. METHODS: A retrospective, non-comparative interventional case series study of 39 eyes of 32 patients with bilateral surface disorders and clinical diagnosis of limbal stem cell deficiency who underwent HLA-matched lr-CLAL. Visual acuity (VA), ambulatory vision (> 20/200) and ocular surface stability were evaluated as main outcomes. Donor limbus was obtained from a sibling or a parent of the patient, after an appropriate Class I and II HLA match. RESULTS: One year after surgery, VA improved in 46.2 percent, ambulatory vision was achieved in 48.7 percent and a stable corneal surface was achieved in 84.6 percent of the eyes. At the final follow-up (mean, 48.7 ± 30.6 months), 66.6 percent of the eyes that had gained VA one year after surgery maintained an improved VA (p=0.28), 94.7 percent of eyes that had achieved ambulatory vision one year after surgery maintained 20/200 or better (p<0.001) and 93.9 percent still had a stable corneal surface (p=0.043) at the final follow-up. CONCLUSIONS: HLA-matched lr-CLAL can be an adequate method of treatment for bilateral ocular surface disorders, with a reasonable percentage of success of long-term results.

OBJETIVO: Avaliar os resultados em longo prazo do transplante alogênico inter vivo de limbo conjuntival para doenças bilaterais da superfície ocular com compatibilidade HLA doador-receptor. MÉTODOS: Estudo retrospectivo, não comparativo e intervencionista de 39 olhos de 32 pacientes submetidos a transplante alogênico de limbo com compatibilidade HLA e diagnóstico de deficiência límbica. Foram analisados como desfechos principais acuidade visual, visão ambulatorial (> 20/200) e estabilidade da superfície ocular. Limbo doador foi obtido de parentes do paciente após estudo de compatibilidade HLA classe I e II. RESULTADOS: Com um ano de pós-operatório, a acuidade visual melhorou em 46,2 por cento, visão ambulatorial foi atingida em 48,7 por cento e estabilidade da superfície corneana em 84,6 por cento dos pacientes. Ao final do seguimento (média, 48,7 ± 30,6 meses), 66,6 por cento dos olhos que haviam ganho acuidade visual um ano após a cirurgia mantiveram esta melhora (p=0,28), 94,7 por cento dos olhos que haviam alcançado visão ambulatorial um ano após a cirurgia mantiveram visão de 20/200 ou melhor (p<0,001) e 93,9 por cento ainda tinham superfície corneana estável (p=0,043) ao final do seguimento. CONCLUSÕES: O transplante alogênico inter vivo de limbo conjuntival com compatibilidade HLA revelou-se método adequado no tratamento de doenças bilaterais da superfície ocular, com uma porcentagem significativa de sucesso a longo-prazo.

Importância do co-cultivo com fibroblastos de camundongo 3T3 para estabelecer cultura de suspensão de células epiteliais do limbo humano / Importance of 3T3 feeder layer to establish epithelial cultures from cell suspension obtained from corneo-scleral rims

OBJETIVO: Avaliar a importância da presença de células 3T3 para estabelecer cultura de suspensão de células epiteliais do limbo obtido de rimas córneo-esclerais. MÉTODOS: Rimas de diferentes doadores tiveram seus estroma posterior e endotélio removidos (n=6). Cada rima foi dividida em três segmentos iguais, que foram colocados em cultura em três diferentes condições: um segmento foi colocado na placa de cultura com o lado epitelial para cima (Grupo A). Os dois segmentos restantes foram tripsinizados e a suspensão de células obtida foi cultivada com (Grupo B) ou sem (Grupo C) células 3T3 irradiadas. As células foram mantidas em meio de cultura "supplemental hormonal epithelial médium" (SHEM), a migração epitelial e a formação de clones nos grupos A, B e C foram avaliadas pela microscopia de contraste de fase e por coloração pela rodamina B. Os resultados foram comparados estatisticamente. RESULTADOS: O crescimento de células epiteliais foi observado em 4/6 rimas (Grupo A). Todas as suspensões de células epiteliais que foram cultivadas com células 3T3 (Grupo B) formaram clones. Nenhuma adesão ou formação de clones verdadeiros (holo ou meroclones) foi observada na cultura de células que foi cultivada sem 3T3 (Grupo C) (p=0,009). CONCLUSÕES: Suspensão de células epiteliais límbicas obtidas de rimas córneo-esclerais no modelo utilizado precisa ser cultivada com células 3T3 para formar clones e estabelecer colônias epiteliais com perspectivas para uso terapêutico na reconstrução da superfície ocular.

PURPOSE: To evaluate the importance of the presence of 3T3 fibroblasts for establishing limbal epithelial cultures from cell suspension obtained from corneo-scleral rims (CSR). METHODS: Corneo-scleral rims from different donors (n=6) had their posterior stroma and endothelium stripped away. Each corneo-scleral rim was divided into three equal segments that were set up in tissue culture in three different conditions: one of the segments was placed with the epithelial side up on the bottom of a 6-well culture plate (Group A). The other two fragments were trypsinized and the obtained cell suspension was cultured with (Group B) or without (Group C) irradiaded 3T3 cells. The cells were cultured in supplemental hormonal epithelial medium (SHEM), the epithelial migration and clone formation in groups A, B and C were evaluated with phase contrast microscopy and rodamine B staining. RESULTS: Epithelial cell growth was observed in 4/6 rims (Group A). All epithelial cell suspensions that were cultured with 3T3 cells (Group B) formed clones. No adhesion or true clone formation (holo- or meroclones) was observed in the cell suspensions that were cultivated without 3T3 (Group C) (p=0.009). CONCLUSIONS: Epithelial cell suspension obtained from corneo-scleral rims in this model needs to be cultivated with 3T3 cells in order to form clones and establish limbal epithelial cell colonies with the potential to be used for ocular surface reconstruction.